Ингибиция изоформ циклооксигеназы у собак in vitro.

Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) представляют собой обширную и разнообразную по химическому строению группу лекарственных средств, широко применяющихся в клинической практике при лечении воспалительных и невоспалительных артропатий, скелетно-мышечных повреждений и болевых синдромов различного генеза.
МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ НПВС

Наиболее важным механизмом действия НПВС является способность ингибировать циклооксигеназу (ЦОГ).  Окисление арахидоновой кислоты происходит в ответ на любое повреждение клеточной мембраны (механическое, химическое, термическое и пр.) или на рецепцию различных регуляторов (гормонов, нейромедиаторов, иммуноглобулинов).

Арахидоновая кислота окисляется двумя альтернативными путями. Один из них контролируется циклооксигеназой, другой путь осуществляется при участии липоксигеназы.

Липоксигеназный путь ведет к образованию лейкотриенов и эйкозаполиеновых кислот.

Циклооксигеназа - фермент, катализирующий превращение свободных полиненасыщенных жирных кислот, в том числе арахидоновой, в простагландины (PG), а также другие эйкозаноиды - тромбоксаны (ТXА2 и TXВ2) и простациклин (PGI2).

Доказано, что простагландины имеют разностороннюю биологическую активность:

а) являются медиаторами воспалительной реакции: они накапливаются в очаге воспаления и вызывают локальное расширение сосудов, отёк, экссудацию, миграцию лейкоцитов и другие эффекты (в основном PGЕ2 и PGI2);
б) сенсибилизируют рецепторы к медиаторам боли (гистамину, брадикинину) и механическим воздействиям, понижая порог чувствительности;
в) повышают чувствительность гипоталамических центров терморегуляции к действию эндогенных пирогенов (IL1 и др.), образующихся в организме под влиянием микробов, вирусов, токсинов (главным образом PGЕ2);
г) играют важную физиологическую роль в защите слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта (увеличение секреции слизи и щёлочи; сохранение целостности эндотелиальных клеток внутри микрососудов слизистой оболочки, способствующее поддержанию кровотока в слизистой; сохранение целостности гранулоцитов и, таким образом, сохранение структурной целостности слизистой оболочки);
д) влияют на функцию почек: вызывают вазоделятацию, поддерживают почечный кровоток и скорость клубочковой фильтрации, повышают высвобождение ренина, выделение натрия и воды, участвуют в гомеостазе калия.

ГИПОТЕЗА ЦОГ1 и ЦОГ2

В начале 90-х годов было идентифицировано две разновидности фермента – ЦОГ1 и ЦОГ2, которые кодируются различными генами. Оба гена ЦОГ очень схожи, как и оба изофермента, имеющие практически идентичные трехмерные структуры. Активные центры двух ЦОГ отличаются только по одному аминокислотному остатку. Так называемая конститутивная ЦОГ1 присутствует в активной форме практически во всех органах и тканях, включая желудочно-кишечный тракт, почки и тромбоциты, и ответственна за опосредование физиологических функций.
ЦОГ2 в норме отсутствует в мозге, почках и макрофагах, однако, ее экспрессия существенно увеличивается на фоне воспаления Медиаторы воспаления, увеличивают экспрессию ЦОГ2 в активированных синовиальных клетках, хондроцитах, полиморфоядерных лейкоцитах, эндотелиальных клетках, гладкомышечных клетках сосудов и т.д. Локализация и способы активации ЦОГ2 указывают на роль этого фермента в синтезе простаноидов, ответственных за такие патологические процессы как воспаление, лихорадка и боль.

СТЕПЕНЬ ИНГИБИЦИИ

В последние годы основное внимание привлечено к созданию не столько более эффективных, сколько - более безопасных НПВС, поскольку даже кратковременный прием этих препаратов может привести к развитию побочных явлений, со стороны желудочно-кишечного тракта, нарушение функции почек и печени, а так же агрегации тромбоцитов.

Хорошо известно, что в ветеринарной практике используются далеко не все НПВС, применяемые гуманитарной медициной. А зачастую многие вет.врачи используют препараты разработанные для животных. Однако опубликованных данных об эффективности или степени ингибиции изоформ ЦОГ  у собак в сравнительном аспекте, в отличие от гуманитарной медицины, не встречается.

Компаниея Интервет провела исследование наиболее распространенных НПВС применяемых для животных в Европе в сравнении с одним из наиболее безопасных медицинских препаратов данной группы (кетопрофена, ведапрофена и немисулида).

Цель исследования – сравнение эффективности препаратов путем  оценки ингибиции изоформ ЦОГ (ЦОГ2\ЦОГ1) в крови собак in vitro.

Исследование проводили по методикам, применяемым в гуманитарной медицине (1).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. В исследовании приняли участие 6 собак (3 кобеля и 3 суки), породы гончая, в возрасте 22-23 месяца. Эти животные использовались для сравнения всех НПВС
2. Определение изоформ ЦОГ1/ЦОГ2 in vitro:
      -активность ЦОГ1 и ЦОГ2 в цельной крови собак (1).
      -определение тромбоксана В2 (TXВ2) (1).

Для анализа активности ЦОГ1 использовалось определение сывороточного тромбоксана В2 (ТхВ2) – стабильного неактивного метаболита тромбоксана А2 (ТхА2). Тромбоксаны образуются в мегакариоцитах и тромбоцитах. Включение в  кольцо эндоперекисей дополнительного атома кислорода позволяет преобразовать PGН2 в ТхА2. ТхА2 крайне неустойчив и самопроизвольно превращается в неактивный метаболит, TXB2 .
 
Определение  простагландина Е2 (PGЕ2), использовалось для определения активности ЦОГ2. Простагландин E2 является одним из первых метаболитов липополисахаридов (ЛПС) при разрушении моноцитов и макрофагов в плазме крови. PGЕ2 опосредует эффекты эндогенных пирогенов в гипоталамусе и играет ключевую роль в развитии лихорадки, а так же оказывает иммуносупресирующий эффект на лимфоциты.

Исследование ЦОГ1.

Образцы крови были собраны в сухие стерильные пробирки. После чего инкубировали с каждым из препаратов НПВП, при температуре 38 Сº   в течение 1 часа, для получения сыворотки крови. После чего кровь центрифугировали (2000 об.мин в течении 10 мин., при 4 Сº). Образцы сыворотки крови были аспирированы и охлаждены до -70 Сº.

TXВ2 определяли ферментно-иммунологическим методом (TXВ2-EIA комплекс, Amersham, UK), согласно инструкции.

Исследование ЦОГ2.

Образцы крови были собраны в пробирки с добавлением  антикоагулянта (гепарин). После инкубировали с добавлением 10 мг/мл ЛПС и каждым НПВС, при температуре 38Сº в течение 24 часов. Затем образцы крови центрифугировали (2000 об.мин в течении 10 мин., при 4 Сº), после отделения белков, образцы плазмы были аспирированы и охлаждены до -70 Сº. Определение PGЕ2 осуществляли ферментно-иммунологическим методом (PGЕ2-EIA комплекс, Amersham, UK) согласно инструкции.

ВЫВЕДЕНИЕ  КРИВЫХ

Результаты выражали в виде процентов ингибирования TXВ2 и PGЕ2  с добавлением НПВС относительно ингибиции контроля. Определения ЕС50 (концентрация ингибирующая 50% ферментов) были сделаны после построения кривой на основании экспериментальных данных (% ингибирования), с использованием нелинейной регрессии (WinNonlin,version 3.2, Pharsight, USA), согласно уравнению  
E = (Emax x C)/ (Cу + ECу50)
E = ингибирующий эффект (% ингибирования)
E max = максимальный ингибирующий эффект
C = концентрация препарата
у = отклонение от кривой  (коэффициент Хилла)
EC50 = концентрация препарата приводящего к 50% подавлению действия фермента

1а. Ингибирование ЦОГ1 и ЦОГ2 в зависимости от концентрации кетопрофена

1б. Ингибирование ЦОГ1 и ЦОГ2 в зависимости от концентрации нимесулида.

1в. Ингибирование ЦОГ1 и ЦОГ2 в зависимости от концентрации ведапрофен

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Представленные данные выражались как среднее значение (+/-) стандартное отклонение. Статистическое сравнение производилось при помощи одностороннего анализа дисперсий (стандартных отклонений) (отношение и значения ЕС50) или с использованием t-критерия Стюдента или рангового критерия Вилконсона. Уровень значимости ρ=0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Ингибирование в сыворотке TXВ2 (определения ЦОГ1) и ингибирование в плазме PGЕ2 (определение ЦОГ2) с определенными концентрациями ведапрофена нимесулида и кетопрофена, представлены в  иллюстрациях 1a, 1б, 1в. Из графиков видно, что ведапрофен и немисулид ингибировали в большей степени ЦОГ2, тогда как степень ингибиции изоформ циклооксигеназы у кетопрофена не отличалась, вне зависимости от дозировки.
2. Селективность  ведапрофена, нимесулида и кетопрофена были оценены с использованием крови собак, путем связывания НПВС с белками плазмы крови.
3. Результатам  исследования показали, что  кетопрофен имел одинаковое соотношение ингибирование ЦОГ1 и ЦОГ2 , тогда как ведапрофен и нимесулид более селективно ингибировали ЦОГ2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ведапрофен является более селективным НПВП для животных в сравнении с кетопрофеном.  Это определяет его как безопасный НПВП в сравнении с катопрофеном не только в отношении побочных эффектов со стороны ЖКТ, но и нарушения функции почек, аггрегации тромбоцитов и негативного действия на хрящ.

Селективность ведапрофена продемонстированна в in vitro в крови собак.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Patrignani P, Panara MR, Greco A, Fusco O, Natoli C, Iacobelli S, Cipollone F, Ganci A, Créminon C, Maclouf J and Patrono C (1994), JPET, 271, 1705-1712.
2. Pairet M and van Ryn J (1998), Infl. Res, 47, supplement 2, S93-S101.
3. Toutain PL, Cester CC, Haak T and Metge S (2001), JVPT, 24, 35-42.
4. Ricketts AP, Lundy KM and Seibel SB (1998), AJVR, vol. 59, № 11, 1441-1446.